A eletroforese é uma técnica analítica utilizada na análise de macromoléculas como proteínas e ácidos nucléicos. Essa técnica foi descoberta e empregada pela primeira vez em 1937 por Arne Tisélius um bioquímico sueco. O efeito eletroforético tem como base a teoria de Debye-Hückel-Onsager, onde esta teoria de dissociação eletrolítica aceita o fato de as partículas carregadas moverem-se sob a influência de forças eletrostáticas para um eletrodo de carga oposta quando é aplicada uma diferença de potencial em uma solução contendo eletrólitos.
A eletroforese é a migração de uma molécula carregada sob a influência de um campo elétrico. A mobilidade eletroforética é dada por:
μ= v/E = Z/f
Onde:
A mobilidade eletroforética (μ) é a razão entre a velocidade(v) da macromolécula e o potencial elétrico(E) que move a macromolécula ou a razão entre a carga líquida(Z) e o coeficiente de atrito(f).
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Suportes para eletroforese
Os suportes para eletroforese comumente empregados são os géis de poliacrilamida para proteínas e agarose para os ácidos nucléicos, em virtude de estes polímeros funcionarem como uma peneira molecular, ou seja, separar as espécies em função de sua massa e tamanho molecular, respectivamente, inibe a propagação do calor em virtude do atrito causado pela migração e pela aplicação do campo elétrico.
Os géis de poliacrilamida são comumente utilizados na separação de proteínas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de coloração com nitrato de prata e corante azul de Coomassie(corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando a identificação das espécies no eletroforetograma), os poros são facilemente ajustáveis através do controle de acrilamida e bis-acrilamida que são os polímeros que formam o gel.
Os géis de agarose são utilizados para macmoléculas com massa molecular a superior a 200 kD visto que os ácidos nucléicos apresentam massas moleculares extremamente grande. A coloração do eletroforetograma de ácidos nucléicos é realizada como brometo de etídio, em fução dos outros corantes provocarem a coração total do gel de agrose impossibilitando a identificação dos ácidos nucléicos.
Eletroforese de macromoléculas em Gel de SDS
A amostra de interesse deve ser preparada com o rompimento da matriz em que encontra-se o composto de interesse, nesse caso é uma célula que é rompida por métodos, físicos ou químicos onde os métodos físicos incluem destruição mecânica ou maceração e métodos químicos funcionam através do rompimento por meio da adição de compostos químicos que não afetem as características físico-químicas, do composto de interesse.
Após a essa preparação a amostra é colocada em uma solução chamada de tampão de amostra que contém em sua composição agentes químicos redutores, desnaturantes e tamponantes. Em seguida essa solução é aquecida a 90ºC por um períodos de 5 a 10 minutos para desnaturação da macromolécula. Um exemplo desses agentes são:
SDS ou dodecilsulfato de sódio: é uma molécula anfifílica usada como desnaturante, ou seja, é um detergente que é adicionado a solução com o objetivo de proporcionar uma carga liquida negativa para a biomolécula de interesse, de modo que ele agrega-se ao redor desta.
Agentes redutores: os agentes redutores comumente utilizados são β-mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol), que agem causando a redução das pontes dissulfeto que são responsáveis pela estrutura nativa da proteína.
Resumidamente o procedimento para eletroforese de macromoléculas é o seguinte:
- As macromoléculas são colocadas em uma solução chamada tampão de amostra contendo SDS, Azul de Bromo-fenol e DTT;
- A solução tampão de amostra contendo as proteínas é aquecida a 90ºC de 5 a 10 minutos;
- Após o aquecimento das proteínas são desnaturadas, suas ligações dissulfeto são quebradas, e o SDS agrega-se ao redor das proteínas proporcionando uma carga líquida negativa.
Mecanismo da eletroforese
Abaixo é descrito o mecanismo da eletroforese.
1 – a amostra contendo as macromoléculas devidamente desnaturadas e reduzidas é distribuída ao nos poços ou cavidades do gel de suporte;
2 - após a distribuição o equipamento é fechado e o campo elétrico é aplicado no gel, através de um dispositivo diferencial de energia elétrica e as macromoléculas vão sendo distribuídas pela extensão do gel e são separadas em função de sua massa e tamanho molecular que são os principais fatores que determinam a mobilidade eletroforética.
No topo do gel existe uma mistura de macromoléculas de variados tamanhos e massas moleculares de modo que quando o campo elétrico é aplicado as moléculas menores migram primeiro, pela malha formada pelo gel. Ao passo que durante a distribuição o gel funciona como uma peneira molecular e as moléculas com massa molecular mais elevada vão sendo retidas ao longo do processo pelas malhas gel o que permite que as macromoléculas sejam analisadas pela sua massa molecular.
No final do processo quando todas as macromoléculas estão ditribuidas o gel é mergulhado em uma solução corante.
Para proteínas são usadas solução de nitrato de prata que detecta proteínas mesmo que a concentração seja muito baixa. Ou o gel é mergulhado em uma solução ácida e alcoólica de corante azul de coomassie. Um período de tempo é aguardo e em seguida observa-se o eletroforetograma que nada mais é do que o gel corado. Para analise de ácidos nucléicos (DNA e RNA) são usados corantes como brometo de etidio, laranja de acridina e profalvina que são corantes com estrutura aromática, quando sob a luz utravioleta apresentam fluorescência.
Focalização Isoelétrica de proteínas em gel de SDS
Uma técnica muito poderosa para analise de proteínas que proporciona alta resolução é chamada Focalização Isoelétrica onde as proteínas são separadas, através de seu ponto isoelétrico.
A focalização isoelétrica consiste na neutralização das cargas das proteínas onde um gel contendo anfólitos (íons que se comportam como ácido e base ao mesmo tempo), é submetido a um campo elétrico de modo que no momento em que os anfólitos migram em direção aos pólos negativos e positivos de acordo com sua carga elétrica e distribuem-se pelo gel cilíndrico, estabelecendo assim um gradiente de pH estável onde as proteínas irão migrar para um local onde seu ponto isoelétrico seja igual o do anfólito. A focalização isoelétrica se processa da seguinte maneira:
- No primeiro gel os anfólitos adicionados são distribuídos com a aplicação do campo elétrico.
- No segundo gel é adicionada a solução de proteínas.
- No terceiro gel é aplicado o campo novamente e as proteínas migram em direção a seu ponto isoelétrico.
O processo de migração termina por que as cargas se igualam, ou seja, pI = pH as cargas se anulam de modo que na equação inicial Z=0, e a proteína é focalizada ou seja ela para exatamente no ponto conhecido.
Eletroforese Bidimensional ou 2D
Essa técnica oferece uma resolução melhor, ou seja, um grau maior de detalhes no eletroforetograma final por que combina a focalização isoelétrica e a eletroforese em gel SDS. De acordo com o esquema abaixo:
Na eletroforese bidimensional o gel da focalização isoelétrica é colocado horizontalmente sobre um gel de sds, o campo elétrico é aplicado e as macromoléculas protéicas são separadas de acrodo com o ponto isoelétrico e em função de sua massa molecular, fornecendo um eletroforetograma que possibilita a visualização e identificação de várias proteínas de uma só vez.
Bibliografia:
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