O sequenciamento do DNA é uma série de processos bioquímicos tem por finalidade determinar a ordem dos nucleotídeos (adenina, guanina, citosina e timina) em uma amostra de DNA.
Até meados da década de 70 era muito complicado obter uma sequência de DNA, independente de ser fita simples ou fita dupla. No começo da década de 80, foi desenvolvida uma técnica rápida de sequenciamento, por meio da quebra de uma cadeia de DNA por diversos produtos químicos, sendo os fragmentos visualizados através do processo de eletroforese. Era necessário marcar as moléculas com radiação, devido à baixa produção de material, não podendo ser detectada de outra maneira.
Poucos anos após houve um novo avanço tecnológico foi conseguido por meio da introdução da técnica de interrupção da sequência através da incorporação ao acaso de um nucleotídeo modificado, sendo chamada de técnica de didesoxi ou dideoxi. Essa técnica, de imediato, tomou o lugar da anterior, possibilitando o desenvolvimento de sequenciadores automáticos de DNA. O sequenciamento manual ainda existe, mas é muito mais trabalhoso, caro e arriscado, pois utilizam-se substâncias radioativas.
Estrutura Química do DNA
Antes de entendermos o processo de sequenciamento de DNA, é importante relembrarmos a estrutura dessa molécula.
A estrutura química do DNA foi elucidada por Miescher, Kossel, Levene e Chargaff, que consiste em uma macromolécula de ácido nucléico composta de 3 tipos de moléculas: um açúcar de 5 carbonos, uma base nitrogenada e um grupo fosfato.
Os açúcares dos ácidos nucléicos, denominados riboses, consistem em cinco carbonos, sendo que desses, quatro encontram-se unidos por uma molécula de oxigênio, em formato de anel, e o quinto carbono encontra-se projetado para fora desse anel. A cada cadeia de carbono ligam-se átomos de hidrogênio ou grupos hidroxilas.
O segundo componente do DNA é a base nitrogenada, formada por duas purinas, a adenina (A) e a guanina (G), e por duas primidinas, a timina (T) e citosina (C). O terceiro elemento, o grupo fosfato, é composto por um átomo de fósforo ligado a quatro moléculas de oxigênio, que frequentemente estão carregados de cargas negativas, tornando o DNA ácido. O fosfato sempre se liga ao carbono 5’ da ribose.
Posteriormente, Watson e Crick desenvolveram um modelo demonstrando que o DNA se assemelha a uma escada em caracol, onde as cadeias polinucleotídicas estão em sentidos opostos e são mantidas unidas por meio de pontes de hidrogênio e ligações covalentes entre o açúcar e o grupo fosfato.
Sequenciamento de DNA
Um dos métodos mais usados é a “técnica de desoxi”, também conhecida como terminadores de cadeia ou Sanger (em homenagem a Fred Sanger, que propôs a técnica em questão).
A síntese de DNA se inicia por meio de um oligonucleotídeo, sendo continuada ao longo da seqüência do molde pela enzima DNA polimerase, incorporada aos nucleotídeos e sintetizada a nova fita. Estão presentes nessa técnica dois tipos de marcadores nucleotídeos: os “normais” (deoxi) – dATP, dGTP, dCTP e dTTP; e os dideoxinucleotídeos (não possuem o grupo hidroxila no carbono 3’) – ddATP, ddGTP, ddCTP e ddTTP, sendo estes marcados com material fluorescente.
A polimerização do DNA prossegue, sendo incluídos os nucleotídeos deoxi até o momento em que a DNA polimerase, por acaso, insere um dideoxinucleotídeo, interrompendo assim a polimerização. Ao final de todo esse processo são observados fragmentos de tamanhos distintos. Essa reação é transferida para um gel onde, após o processo de eletroforese, é observada a migração dos fragmentos.
Quando o método utilizado é o manual, os dideoxinucleotídeos são marcados com radiação e não com substâncias fluorescentes, sendo então necessária uma radiografia para a visualização da seqüência de DNA. Já no seqüenciamento automático, o seqüenciador identifica os fragmentos por meio da incidência de laser sobre os dideoxinucleotídeos fluorescentes. Por fim, o seqüenciador mostra um gráfico onde cada nucleotídeo é referenciado com cores distintas.
Fontes:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Sequenciamento_de_ADN
https://web.archive.org/web/20100718114127/http://www.cca.ufscar.br:80/lamam/wp-content/uploads/2010/07/sequenciamento.htm
https://web.archive.org/web/20120419115834/http://www.ufpe.br:80/biolmol/aula8-sequenciamento.htm
http://www.geth.org.br/index2.php?option=com_content&do_pdf=1&id=194